Badana próbka zawierająca białko jest wzbudzana liniowym światłem spolaryzowanym. Dichroizm kołowy powoduje zmianę polaryzacji światła z liniowej na eliptyczną. Światło spolaryzowane kierowane na próbkę traktuje się jak wektor elektryczny składający się z wektorów elektrycznych dwóch spolaryzowanych kołowo fal świetlnych, które mają tę samą amplitudę i fazę, lecz przeciwne kierunki rotacji (polaryzacja prawo- i lewoskrętna).

W ośrodku aktywnym optycznie (białko) występują różnice w prędkościach rozchodzenia się tych fal i we współczynnikach absorpcji. Efekt różnic w prędkości rozchodzenia się fal jest źródłem przesunięcia w fazie wektorów pola elektromagnetycznego obu składowych względem siebie, co prowadzi do skręcenia wypadkowego wektora po przejściu przez próbkę z białkiem o pewien kąt. Różnica we współczynnikach absorpcji powoduje różnicę amplitud dla obu fal, co z kolei prowadzi do pojawienia się polaryzacji eliptycznej.

Widma CD przedstawiające zależności sygnału CD od długości fali światła znalazły szerokie zastosowanie przy określaniu struktury drugorzędowej białek. FLC, ze względu na to, iż wykazują aktywność optyczną, dają silny i zróżnicowany sygnał CD w paśmie absorpcji wiązania peptydowego (160-240 nm) zależny od przyjmowanej struktury drugorzędowej. Znaczne różnice w charakterze przebiegu widm CD dla poszczególnych rodzajów struktur drugorzędowych umożliwiają wyznaczenie ich procentowego udziału w całkowitej strukturze białka. Analiza taka oparta jest głównie na metodach porównawczych, które wykorzystują znajomość widm wzorcowych dla poszczególnych struktur drugorzędowych.

W kontekście porównywania stabilności termodynamicznej białek można w ten sposób różnicować poszczególne klony, ale także wniostkować o ich budowie – strukturze drugorzędowej.