Zjawisko migracji molekuł

Elektroforeza jest zjawiskiem wędrówki molekuł obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Elektroforezę stosuje się do rozdzielania i wizualizacji takich biomolekuł jak białka i kwasy nukleinowe, ale również mniejszych peptydów. W ogólnym ujęciu o szybkości migracji molekuł w polu elektrycznym decyduje natężenie pola elektrycznego, wypadkowy ładunek molekuły, jej wielkość oraz kształt, a także lepkość środowiska.

Elektroforeza żelowa, w odróżnieniu od elektroforezy kapilarnej, realizowana jest w żelu otrzymanym na drodze polimeryzacji odpowiednich substancji. Żel pełni rolę sita molekularnego. Innymi słowy, duże molekuły, posiadając mniejszą swobodę poruszania się w strukturach żelu, migrują wolniej niż ma to miejsce w przypadku molekuł mniejszych. Białka najczęściej poddaje się analizie elektroforetycznej w żelach poliakrylamidowych.

Elektroforeza białek

Białka analizuje się na drodze elektroforezy w różnych wariantach tej techniki, w zależności od pożądanego wyniku, rodzaju próbki itd. W elektroforezie natywnej analizowane są białka w ich naturalnej, niezdenaturowanej formie. Częściej jednak stosowana jest elektroforeza w warunkach denaturujących, kiedy to ruchliwość białek w żelu jest niezależna od kształtu formy natywnej. Dodatkowo stosuje się inne modyfikacje, do których należy elektroforeza dwukierunkowa, pozwalająca na uzyskanie lepszego rozdzielenia białek.

SDS‑PAGE

Jedną z najpowszechniej wykorzystywanych technik w analizie białek jest SDS‑PAGE (ang. SDS poliacrylamide gel electrophoresis). Jest to proces rozdzielenia elektroforetycznego w warunkach denaturujących z wykorzystaniem SDS, czyli dodecylosiarczanu sodu. SDS‑PAGE jest techniką, która pozwala w pełni uniezależnić proces rozdzielania białek od ich kształtu i ładunku elektrycznego. Dzięki temu uzyskiwany wynik jest stosunkowo prosto interpretowany na podstawie zależności drogi, jaką przebyło białko w żelu, od jego masy molekularnej.

Mechanizm SDS‑PAGE

Przygotowanie próbek do analizy SDS‑PAGE wymaga dodatku specjalnego buforu zawierającego w swym składzie SDS i substancję redukującą, a także denaturacji termicznej białek (poprzez ogrzanie do 95-100°C przez kilka minut). SDS jest detergentem jonowym, który niszczy oddziaływania niekowalencyjne decydujące o przestrzennej strukturze molekuły białkowej. Efekt denaturacji jest zapewniany definitywnie przez ogrzewanie próbki do wysokiej temperatury. Zawarty w buforze czynnik redukujący, na przykład DTT (ditiotreitol), odpowiada za niszczenie mostków dwusiarczkowych w strukturach białek. Ponadto, obecność SDS uniezależnia szybkość migracji molekuł od ich ładunku, ponieważ ten anionowy detergent warunkuje nadanie wszystkim białkom dużego ujemnego ładunku.

W efekcie działania powyższych czynników białka poruszają się w żelu w kierunku elektrody dodatniej z szybkością zależną jedynie od ich wielkości.

Przebieg elektroforezy

Odpowiednio przygotowane próbki nanosi się na pionową płytkę żelu poliakrylamidowego, do zagłębień zwanych studzienkami - sporządzony wcześniej żel umieszczony jest w specjalnej aparaturze w środowisku buforu o odpowiedniej sile jonowej oraz pH. Próbki białkowe zawierają glicerol co sprawia, że nie wydostają się one ze studzienek żelowych, a raczej opadają na ich dno. Wówczas, po przyłożeniu napięcia, rozpoczyna się migracja molekuł w strukturach żelu.

Najczęściej stosuje się tak zwany system nieciągły. W tym systemie żel przygotowywany jest w ten sposób, że białko najpierw wędruje w jego górnej części o mniejszym stopniu usieciowania, gdzie próbka ulega zagęszczeniu (żel zagęszczający). W dolnej części natomiast stopień usieciowania żelu jest większy i to tam następuje właściwe rozdzielenie mieszaniny białkowej na poszczególne frakcje zależnie od masy molekularnej (żel rozdzielający). Różnica w stopniu usieciowania żelu uzyskiwana jest poprzez różną zawartość czynników sieciujących. Im więcej poliakrylamidów i czynników warunkujących polimeryzację, tym gęstsze sito molekularne żelu – wtedy też proces migracji jest wolniejszy, ale możliwe staje się efektywne rozdzielenie mieszanin mniejszych biomolekuł.

O długości procesu elektroforezy decyduje także wysokość przyłożonego napięcia. Im większe napięcie pomiędzy elektrodami, tym szybszy rozdział elektroforetyczny. Należy jednak pamiętać, że zwykle szybka elektroforeza pod wyższym napięciem wiąże się z niekorzystnym przegrzewaniem buforu elektroforetycznego i niższą rozdzielczością uzyskanego elektroforegramu.

Wizualizacja

Po zakończeniu procesu rozdzielania elektroforetycznego, żel poddaje się wybarwieniu. Jednym z częściej stosowanych barwników jest Coomassie Brilliant Blue (CBB), tym nie mniej większą czułość obserwuje się przy wykorzystaniu metody barwienia srebrem. Po wybarwieniu żelu, uzyskiwany jest obraz w postaci prążków. Każdemu prążkowi, o ile jest rozróżnialny, odpowiada białko o określonej masie molekularnej. Do interpretacji wyników niezwykle przydatny jest tak zwany marker masy, który przed elektroforezą nanosi się do jednej ze studzienek, obok próbek. Markery dostępne są komercyjnie i zawierają w swym składzie białka o ściśle określonej masie molekularnej – na tej podstawie można wnioskować o wielkości białek z sąsiednich próbek. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie może także posłużyć do elektrotransefru „uwięzionych” w nim białek na specjalną błonę, a w następstwie tego do specyficznej detekcji tych białek z wykorzystaniem przeciwciał w metodzie Western blotting.