Naukowcy z Uniwersytetu Cambridge opracowali szybki system detekcji DNA, który nie wymaga specjalistycznego laboratoryjnego wyposażenia (np. programowane termocyklery) i który może być łatwo implementowany w przenośnych biosensorach. System RPA (ang. Recombinase Polymerase Amplification) oparty jest na specyficznej amplifikacji DNA z wykorzystaniem rekombinazy z bakteriofaga T4 i polimerazy Bsu (duży fragment Pol I z Bacillus subtilis). Proces powielania określonej sekwencji DNA prowadzony jest w niskiej i stałej temperaturze. Eliminacja krzywej temperaturowej procesu PCR, zadawanej specyficznym program termicznym w termocyklerze, stała się możliwa dzięki zastosowaniu rekombinazy uvsX. Enzym ten w obecności ATP wiąże się do oligonukleotydów tworząc specyficzny kompleks nukleoproteinowy, który z kolei aktywnie hydrolizuje ATP, co prowadzi do dysocjacji kompleksu rekombinaza-oligonukleotyd i zastąpienia enzymu przez białka wiążące pojedyncze nici DNA (tutaj: białko gp32 pochodzące z bakteriofaga T4). Pierwszym etapem w izotermalnej amplifikacji RPA jest proces skanowania podwójnej nici DNA przez kompleksy nukleoproteinowe rekombinaza-starter1 i rekombinaza-starter2. Po odnalezieniu miejsc homologicznych następuje rozluźnienie podwójnej struktury kwasu dezoksyrybonukleinowego i wymiana pojedynczych oligonukleotydowych odcinków DNA. Następnie hydroliza nukleoproteidowego kompleksu prowadzi do oddysocjowania rekombinazy i zasocjowania białek wiążących pojedynczą nić DNA co jest niezbędne do podtrzymywania widełek replikacyjnych. Po tym etapie polimeraza Bsu amplifikuje odcinki DNA w przeciwnych kierunkach zgodnie z orientacją związanych starterów doprowadzając do powstanie dwóch pojedynczych, docelowych odcinków DNA (obok oryginalnej matrycy). Autorzy pracy wykazali, że amplifikacja prowadzona z użyciem systemu RPA, podobnie jak w konwencjonalnym PCR charakteryzowała się wykładniczą charakterystyką. Dolna granicę wykrywalności określono na 10 kopii genomowego DNA. Jednakże po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji systemu RPA osiągnięto maksymalną możliwą czułość – wykrywalność 1 kopii matrycowego DNA. W tym celu zmodyfikowano startery poprzez dodanie do każdego z nich fluorochromu na jednym końcu i związku gaszącego fluorescencję na drugim. Tuż za właściwą sekwencją startera dodano THF (tetrahydrofuran) specyficznie rozpoznawalny przez endonukleazę IV (Nfo pochodzącą z E. coli). Endonukleolityczne cięcie fragmentu podwójnej nici DNA uwalnia wolny koniec 3’-OH startera i fizycznie rozdziela wygaszasz fluorochromu od samego fluorochromu czego konsekwencją jest emisja określonej długości fali (koloru). W ten sposób, pomiarów amplifikowanego DNA w systemie RPA można dokonać z użyciem prostego kolorymetru. Osiągnięcia angielskich naukowców pozwolalają myśleć o molekularnych testach diagnostycznych w kategorii przenośnych platform badawczych – biosensorów o kieszonkowych rozmiarach.


PloS Biol (2006) 4 (7): 1115:1121